摘要：本文简要介绍了分子对比剂在光学相干层析成像（Optical Coherence Tomography,即OCT）技术中的研究现状，概述了迄今出现的几种不同的光学相干层析分子成像（molecular contrast OCT，简称为MCOCT）方法，并讨论了MCOCT 的几个重要的实际问题：对比剂的选择范围、激发光强的限制、各种方法灵敏度比较以及MCOCT 应用于临床及生物学领域需要考虑的问题。
关键词：OCT， Optical Coherence Tomography; MCOCT , Molecular Contrast Optical Coherence Tomography；灵敏度
1. 引言
光学相干层析成像（OCT），凭借其独特的相干门技术和干涉测量优势，能无损伤地观察生物体表面以下的组织结构，并具备组织病理分析所需的高空间分辨率，有望成为体光学成像研究中的重要手段。继OCT 结构成像方法提出之后，OCT 功能成像方法也相继诞生。如多普勒OCT 将多普勒技术与OCT 相结合，提供生物组织内部高分辨血管分布和速度分布图像；偏振OCT 则利用光的矢量特性来探测生物组织内部的双折射分布信息。现行OCT 技术，依据弹性散射光所固有的振幅、位相和偏振等信息，来反映组织内部的结构形态特征与生理功能状况。然而，结构形态的变化作为预示性信息，只能作为间接定性的依据。而且，当疾病尚无临床症状时，往往只涉及分子层次上的改变，并不出现物理性状方面的后端变化。尽管功能成像和内部分子有一定的间接关联，但并不具备分子特异性。因此，如果能将现有的OCT 技术发展为具有特异性分子识别功能，在获取了高分辨结构和功能信息的同时，又能获取分子组成和分布信息，这无疑是OCT 技术和在体光学成像技术的一大飞跃。
事实上，OCT分子成像研究已经成为国际OCT领域的重要发展方向。至今已报到的OCT 分子成像方法，大体可分为三大类。第一类利用对比剂的吸收性质提取对比信息。这一类又可继续划分为两类：一类描绘对比剂分布的方法是改变注入到生物目标的特定分子对比剂的吸收光谱，通过采集变化前后的OCT扫描图样获得的。两幅OCT扫描图样的差别经过处理就能得到对比剂的分布。另一类方法利用对比剂的吸收光谱曲线被动的描绘出对比剂的分布。
MCOCT机制的第二大类是基于利用特殊的分子对比剂，它能够有效地并且相干地将照明光场转变为可用干涉仪探测的辐射光场。第三大类是利用专门设计的对比剂的特殊散射特性描绘出目标样品内的对比剂分布。接下来的三节将会详细讨论每一类的例子。
2. MCOCT方法简介
2.1 基于吸收的MCOCT方法
已报到的MCOCT 方法有四种是属于这一类的：泵浦探针OCT[1] ，泵浦抑制OCT[2] ，光谱OCT[3，4]以及光谱三角测量OCT[5] 。此类技术均依赖于向目标样品引入具有特定的光学可激发跃迁或可识别的吸收光谱的分子对比剂。
泵浦探针OCT即Pump-probe OCT, 简称PPOCT，是最早报道过的实现MCOCT的成像方法。PPOCT的工作原理简单且直接--光激发场在OCT探针波长处将染料分子激发到寿命相对长的三重态来改变染料的吸收截面。该技术的难点在于如何建立一个足够快的OCT成像系统获得染料分子三重态时的OCT信号。尽管相对分子能级转化时间，三重态2 μ s的能级周期已
经算是长的，但是相对于基于泵浦探测的成像技术来说，该时间仍然太短。如此短的时间延迟，在每个泵浦探测周期只有用足够的时间来采集单个OCT像素。在采样周期的后半部分维持激发场强度不变可能会极大地提高系统效率。然而，这必然导致大剂量光辐射。
另一类MCOCT为解决上述短跃迁周期问题变化选择稍微不同的分子跃迁机制——分子构象变化。像这样的分子对比剂有两个：噬菌调理素（bR）[6]和光敏色素A（PhyA）[7]。这种方法中MCOCT的成像方式与PPOCT 中的成像方式有很大的差别：其分子从一个能级转换到另一个能级无需高强度的光激发。泵浦抑制MCOCT的优点在于所需的泵浦探针光强要求不高，但该方法可用的分子对比剂的种类有限。
光谱OCT利用近红外染料分子（靛青绿）吸收峰处于探测光谱范围内的特点[8]，能够提供组织的光谱信息，只是成像的分辨率会下降。如果光谱信息能够揭示具体的组织参数，例如散射或吸收光谱特征，图像分辨率受限也是可以接受的。这种MCOCT成像方法有以下几个优点：1）被动式探测，无须泵浦光激发；2）对比剂的选择范围比较广。这些优点使得光谱OCT成为一种很有潜力的分子成像方法。文献[8]报道的光谱OCT实验方案所用的光源及染料的吸收光谱如图1所示。图1（a）是脉管束中注入染料的芹菜梗的光谱OCT图像，图1（b）是芹菜梗相同区域不加染料时的光谱OCT 图像，图1（c）和（d）分别为芹菜梗脉管束及周围厚角组织的荧光显微图像和普通的光学显微图像。从几幅图像的对比可以看出，加了荧光染料，芹菜组织的分子特异性更加清晰。
光谱三角MCOCT可以补偿目标样品固有的一级光谱变化，从而大大提高了MCOCT的成像质量。
2.2 基于相干激发的MCOCT 方法
目前，已报道的MCOCT方法有两种是属于这一类的：二次谐波OCT（SH-OCT）[9、10]， 基于相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）的OCT分子成像（被其研发者称为非线性干涉振动成像，即NIVI）[11]。这两种方法的原理都是利用目标样品内的分子对比剂有效的将入射OCT 探针光场相干的转化为可用相干方法探测的辐射光场。SH-OCT 和NIVI MCOCT通常需要用超短脉冲光作光源，因为超短脉冲光源既有利于提高非线性转化效率，又能实现基于相干门的轴向分辨。
SH-OCT对于骨胶基质的成像以及提取生物样品的取向信息非常有效。原则上，具有高阶非线性极化率的不对称大分子如噬菌调理素（bR）,都可以用作SH-OCT的分子对比剂。SH-OCT的信噪比灵敏度接近SHG显微镜，另外由于利用了OCT的相干门，其轴向分辨率大大提高。
NIVI在反斯托克斯拉曼散射对比机制中利用了目标分子对比剂的三阶非线性光学极化。参考文献[12] 首次报告了这种方法。这种方法利用了两个高强度光源：斯托克斯光（S） 和泵浦光（P），目标聚焦区域的波长分别为λS 和λP ，如图2所示。它利用四波混频过程的
三阶非线性光极化产生一个激发场：反斯托克斯场（AS），其光频为λAS 。由于分子对比剂有一个振动模式与斯托克斯场产生共振，因而，分子对比剂的存在增强了AS场的产生。这个AS场与S场和P场有确定的相位关系。参考臂试管里装满高浓度的相同分子，产生类似的AS场，样品产生的激发场与这个参考AS场叠加干涉就可以测量样品内的对比剂分布。利用这种方法，只要合理选择S和P场的波长以及合适的分子振动模，S、P、AS的波长可以相当接近。在OCT成像方案中可以利用这个特征将S、P、AS都控制在红外或近红外波段以便将组织散射的影响降到最低。NIVI的信号产生过程基于三阶非线性极化，其产生的信号相比SH-OCT必然更为微弱，
因而信号的探测以及激发光场的强度就是需要考虑的主要问题。但是这种方法有个显著的优点：可能同时对样品内的多种分子成像。NIVI的这个优点使得CARS成为一种非常值得进一步研究的分子成像方法。
图2 CARS干涉仪测量系统及干涉信号包络
2.3 基于散射的MCOCT方法迄今已报道的MCOCT方法有两种是基于散射测量的：工程化散射MCOCT[13] 和磁调制MCOCT[14] 。其工作原理利用对比剂产生强烈的散射，根据测得的散射信号与对比剂浓度的关系反映对比剂的分布情况。工程化散射MCOCT利用外加的散射对比剂—蛋白质壳微球，经过处理的蛋白质微球与
组织内的细胞相互作用，使得存在对比剂的组织区域有强烈的散射，测量散射信号就可反映对比剂的分布情况。如图3所示。
图3 （a）和（b）显示充满油的微球对比剂壳内硅纳米粒子散射的电子显微镜照片
（a）扫描电子显微镜照片（b）透射电子显微镜照片（c）和（d）分别显示有金外壳的充满油的微球对比剂时的老鼠肝脏的OCT图像及没有对比剂时的图像磁调制MCOCT直接利用对比剂的散射，所用的对比剂是由磁赤铁矿物粒子组成的。文献[14] 报道了这种方法：对比剂是巨噬细胞的细胞培养经过嗜菌作用完成的，如图4所示。用OCT系统在振荡磁场（约300G ，频率为1kHz ）存在的条件下对细胞培养成像。通过锁定
发生在磁场振荡频率处的图像信号变化就会得到样品内的磁粒子分布。
散射型OCT分子成像方法能否成为可行的OCT分子成像方法还有待进一步研究。
需要指出，无论是吸收型OCT分子成像方法，还是散射性OCT成像方法，它们共同的局限性是采用了可能改变生物体自然状态的外源性对比剂，而利用相干辐射类OCT分子成像方法则可望避免这一问题。基于光学非线性的相干辐射类OCT分子成像方法，利用CARS、SHG 与OCT外差干涉测量的协同优势，实现内源性分子的直接成像，因而开拓了无需标记的分子成像新途径。
3.讨论
3.1 对比剂的选择及对比剂的毒性
MCOCT所用的对比剂的选择问题是需要首先考虑的因素，通常是根据各种MCOCT 方法的具体工作原理来选择对比剂的，例如：PPOCT 利用分子跃迁到三重态过程中的吸收截面变化来提取信号，因而具有较长三重态驰豫时间的分子对比剂就是PPOCT的首选对比剂。
MCOCT一个主要的应用就是对生物组织的成像，因而MCOCT成像过程的毒性问题值得关注。与MCOCT成像相关的毒性问题必须考虑两个方面：1）参入成像的对比剂的固有毒性；2）由于成像过程中的光化学作用产生的副产品的毒性。
3.2 激发光光强
任何MCOCT成像方法应用于生物医学研究或临床之前，除了需要考虑前面提到的毒性问题也需要考虑到成像对目标可能造成的光学损伤。关于激发光强，通常需要考虑三方面限制条件：第一种限制是不可逆的细胞损伤界限，它适用于不包括人体的生物医学研究领域。另外两种限制依据的是ANSI制定的对人体运用激光的安全指导[15] 。相比光损伤限制，ANSI 的限制要严格得多。
3.3 信噪比依据OCT系统的SNR（信噪比）可以写出MCOCT系统的SNR：
（1）
PS0 ：样品全反射时得到的信号臂信号强度；ε ：探测效率；hν ：OCT光源的量子能量；R(z) ：样品反射率；
ua(λ,zs) ：吸收系数；
us(λ,zs) ：散射系数；
.n(z).σ
.L ：表征不同MCOCT系统的对比剂灵敏度。
每种基于吸收的MCOCT方法的探测灵敏度的表示可选择合适的.n(z) 和.σ 代入公式
（1）。
这里主要讨论MCOCT系统的灵敏度与对比剂浓度的关系。分析各种MCOCT 方法的信噪比（SNR）表达式发现：SNR都与对比剂浓度的平方有关，这就意味着MCOCT 的相对灵敏度与对比剂的浓度无关，各种方法的相对灵敏度主要与对比剂的吸收、散射、转换效率、有效截面积有关。对于同样的对比剂浓度，基于散射的MCOCT要比基于吸收的MCOCT的灵敏度高，基于吸收的MCOCT要比基于相干激发的MCOCT的灵敏度高。
4. 结论
由于光和物质的相互作用有很多的作用形式，OCT成像机制也会有很多方法可以追迹对比剂的分布图样。本文已经讨论了迄今已报道的各种MCOCT实验装置方法。它们可以近似的分为以下几类：吸收型、散射型和相干辐射型。
MCOCT成像方法对于临床诊断疾病以及生物医学研究将会有广泛而深远的影响，但是目前这个领域还存在下面两方面的缺陷：开发合适的对比剂以及如何使对比剂与特定的生化样品合适结合实现功能化。
参考文献
[1] Rao, K.D., M.A. Choma, S. Yazdanfar, A.M. Rollins, and J.A. Izatt (2003), Molecular contrast in optical coherence tomography by use of a pump-probe technique. Optics Letters 28, 340-342.
[2] Yang, C., M.A. Choma, L.E. Lamb, J.D. Simon, and J. Izatt (2004), Protein based molecular contrast OCT with phytochrome as the contrast agent. Optics Letters 29,1396.
[3] Xu, C., J. Ye, D.L. Marks, and S.A. Boppart (2004), Near-infrared dyes as contrastenhancing agents for spectroscopic optical coherence tomography. Optics Letters 29, 1647.
[4] Ye, J. and S.A. Boppart. Spectroscopic OCT of infrared dyes as contrast agents. In CLEO/QELS. 2003. Baltimore, Maryland.
[5] Yang, C., L.E. Lamb, J.D. Simon, M.A. Choma, B. Applegate, and J. Izatt (2004), Spectral Triangulation Molecular Contrast Optical Coherence Tomography with Indocyanine Green as the Contrast Agent. Optics Letters, accepted.
[6] Haupst, U., J. Tittor, and D. Oesterhelt (1999), Closing in on bacteriorhodopsin: progress in understanding the molecule. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 367.
[7] Fankhauser, C. (2001), The phytochromes, a familiy of red/far-red absorbing photoreceptors. Journal of Biological Chemistry 276, 11453-11456.
[8] Xu, C., J. Ye, D.L. Marks, and S.A. Boppart (2004), Near-infrared dyes as contrast enhancing agents for spectroscopic optical coherence tomography. Optics Letters 29, 1647
[9] Jiang, Y., I. Tomov, Y. Wang, and Z.P. Chen (2004), Second-harmonic optical coherence tomography. Optics Letters 29, 1090.
[10] Yazdanfar, S., L.H. Laiho, and P.T.C. So (2004), Interferometric second harmonic generation microscopy. Optics Express 12, 2739.
[11] Vinegoni, C., J.S. Bredfeldt, D.L. Marks, and S.A. Boppart (2004), Nonlinear optical contrast enhancement for optical coherence tomography. Optics Express 12.
[12] Marks, D.L. and S.A. Boppart (2004), Nonlinear interferometric vibrational imaging. Physical Review Letters 92, art. no.-123905.
[13] Lee, T.M., A.L. Oldenburg, S. Sitafalwalla, D.L. Marks, W. Luo, F.J. Toublan, K.S. Suslick, and S.A. Boppart (2003), Engineered microsphere contrast agents for optical coherence tomography. Optics Letters 28, 1546 - 1548.
[14] Oldenburg, A.L., J.R. Gunther, D.L. Marks, F.J. Toublan, K.S. Suslick, and S.A. Boppart (2003), Selective OCT imaging of cells using magnetically modulated optical contrast agents. CLEO/QELS conference in Baltimore, Maryland.
[15] American_National_Standards_Institute (2000), Safe Use of Lasers. in ANSI Z 136. pp. 1-2000. Laser Institute of America: Orlando, Florida.
The Analysis for the current state of research on MCOCT
Ling Wang Ding Zhihua Liu Xu
State Key Lab of Moderm Optical Instrumentation , Zhejiang University,Hangzhou 310027
Abstract
. This paper reviews the current state of research on the use of molecular contrast agents in Optical Coherence Tomography (OCT) imaging techniques. We present an overview of the different molecular contrast OCT (MCOCT) methods that have been developed thus far. We will then discuss several important practical issues that define the possible range of contrast agent choice , the light intensity limits , and comparison of the detection sensitivity for each MCOCT method. Then we will discuss several practical issues that should be considered on MCOCT methods for clinical or biological applications.
Keywords: OCT, Optical Coherence Tomography ; MCOCT Molecular Contrast Optical Coherence Tomography ; sensitivity
作者简介：王玲，，浙江大学信息科学与工程学院光电系测试计量技术与仪器方向博士研究生，主要研究领域为光学相干层析分子成像、双光子荧光成像。
王玲 丁志华 刘旭
浙江大学现代光学仪器国家重点实验室，杭州 310027
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